ß-nicotinamidmononukleotid (NMN) produktion i Escherichia coli

Abstrakt

Diabetes er en kronisk og progressiv sygdom med konstant stigende udbredelse og stigende økonomisk pres på de verdensomspændende sundhedssystemer. For nylig blev insulinresistensen, kendetegnende for type 2-diabetes, helbredet hos mus behandlet med NAD ⁺ -forløber ß-nicotinamidmononukleotid (NMN) , hvor der ikke blev rapporteret om toksiske effekter. NMN har dog en høj prislapp, der er behov for mere omkostningseffektive produktionsmetoder. Denne undersøgelse foreslår en bioteknologisk NMN-produktionsmetode i Escherichia coli . Vi viser, at bicistronisk ekspression af rekombinant nicotinamidphosphoribosyltransferase (Nampt) og phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) -syntetase i nærvær af nicotinamid (NAM) og lactose kan være en vellykket strategi for omkostningseffektiv NMN-produktion. Proteinekspressionsvektorer, der bærer NAMPT-gen fra Haemophilus ducreyi og PRPP-syntetase fra Bacillus amyloliquefaciens med L135I-mutation, blev transformeret i Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. NMN-produktion nåede maksimalt 15,42 mg pr. Liter bakteriekultur (eller 17,26 mg pr. Gram protein) i disse celler dyrket i PYA8-medium suppleret med 0,1% NAM og 1% lactose.

Introduktion

Ifølge International Diabetes Federation var antallet af voksne med diabetes type 2 425 millioner i 2017, og det forventes at ramme 649 millioner inden 2045. På verdensplan bruges 12% af sundhedsbudgettet (eller 727 milliarder dollars) til behandling af diabetes. Nylige undersøgelser koblet insulinresistens, kendetegnende for type 2-diabetes, til faldet i mitokondriefunktion og faldet NAD ⁺ -niveauer samt NAD ⁺ / NADH-forhold, også observeret i aldring. NAD ⁺ er til stede i alle levende organismer og er et velkendt co-enzym i oxidationsreduktionsreaktioner. NAD ⁺ -afhængige proteindeacetylaser såsom SIRT1 og SIRT6 tjener som metaboliske sensorer og regulerer nedstrømsveje, som til sidst genopretter mitokondrial funktion og insulinfølsomhed. Denne konstatering udvider NAD ⁺ -forskningsområdet til andre degenerative sygdomme forbundet med aldring, såsom: hjerte-kar, kræft, arthritis, osteoporose eller Alzheimers sygdomme.

P-nicotinamidmononukleotidet (NMN) er et mellemprodukt i NAD ⁺ biosyntese produceret fra nicotinamid (NAM) og phosphoribosylpyrophosphat (PRPP) af nicotinamidphosphoribosyltransferaseenzym (Nampt) (EC 2.4.2.12). NMN viste sig at være godt tolereret uden rapporterede bivirkninger under langvarig administration hos mus og forhindre aldersassocieret fysiologisk tilbagegang, NMN viste sig at være effektiv til behandling af diæt-induceret type 2-diabetes med højt fedtindhold ved at vende mitochondrial dysfunktion forbundet med aldring og redde virkningen af aldersrelateret nedgang i neurale stamceller.

NAM konverteres sædvanligvis til NMN af enzymer involveret i NAD ⁺ redningsveje, såsom Nampt. Virkningen af dette enzym udgør den vigtigste NAD ⁺ anabolske aktivitet i cellen. Regulering af pattedyrs- eller mikroorganismer-nukleotidmetabolisme og biosyntese foregår normalt ved forbrug af PRPP. PRPP resultater fra ribose-5-phosphat via både oxidative og ikke-oxidative grene af pentosephosphatvej.

Hos bakterier omdannes NAM oftest til nicotinsyre (NA) af nicotinamidase, som er integreret i Preiss-Handler-stien, hvilket også er tilfældet med Escherichia col . Hos pattedyr blev nicotinamidase-aktivitet ikke rapporteret; NAM konverteres til NMN af en af NAM-phosphoribosyltransferaseenzymer i stedet. Selvom de fleste af bakterier mangler NAM-phosphoribosyltransferase, udtrykkes enzymet i Haemophilus ducreyi og Shewanella oneidensis .

Enkle og metabolisk alsidige organismer, såsom Escherichia coli , bruges ofte i bioteknologi til kontrolleret ekspression af proteiner med ønsket enzymatisk aktivitet. DNA'et, der koder for sådanne enzymer, introduceres ofte i bakterier ved ekspressionsvektorer, såsom pET-system fra Novagen. PET-vektorerne transformeres i bakterier, der udtrykker T7 RNA-polymerase, såsom E. coli BL21 (DE3). Enzymes ekspressionsstyring opnås ved hjælp af lac- promotor, der kun tænder ekspressionen i nærværelse af lactose (også metaboliseret som en kulstofkilde) eller dens syntetiske strukturelle analog, Isopropyl-1-Thio-ß-D-galactopyranoside (IPTG) ( metaboliseres ikke med konstant koncentration under vækstprocessen). Da bakteriemetabolisme er alsidig, er variationen i kulstofkilde og koncentration af medium-suppleret enzymsubstrater nøglefaktorer, der skal tages i betragtning i en bioteknologisk proces.

Med henblik på at tackle det aktuelle høje prisproblem ved NMN , i vores tidligere arbejde foreslog vi en oprensningsmetode fra bakterieceller. For yderligere procesoptimering, da vi kun var i stand til at finde en offentliggjort gærproduktionsmetode, foreslår denne undersøgelse en enkel og omkostningseffektiv NMN-bioteknologisk produktionsmetode i Escherichia coli .

Resultater

Bakteriel transformation

Den multiple aminosyresekvensindretning genereret for formodet NadV fra Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 og Nampt fra Mus musculus , viser stor lighed (fig. S1), hvilket gør alle disse enzymer kandidater til en bioteknologisk proces.

Transformeret E. coli- celler med nadV (NAMPT) gener båret af pET28a (+) plasmider dannede kolonier på LB Agar-pladerne suppleret med kanamycin. Ingen kolonier blev påvist på plader inokuleret med ikke-transformerede bakterieceller. Agarosegelelektroforese af plasmid-DNA isoleret fra disse kolonier bekræftede tilstedeværelsen af Nampt-PET28a, pET28a-soNadV eller pET28a-hdNadV-plasmider i E. coli DH5a (Supplerende fig. S2A, bane 2, 3, 4). DNA-båndene matchede båndene fra E. coli BL21 (DE3) pLysS-celler (supplerende fig. S2A, bane 6, 7, 8), som blev transformeret med tilsvarende plasmider ekstraheret direkte fra E. coli DH5a. I ikke-transformeret E. coli BL21 (DE3) pLysS-celler, anvendt som negativ kontrol, tilstedeværelsen af pLysS-plasmidet blev bekræftet ved elektroforese, et bånd, der matchede den kendte længde på 4886 bp (Supplerende fig. S2A, bane 5), blev vist på agarosegel.

(For mere eksperimentelle data, se det originale websted: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)